رضا عالی زاده، نسرین کاردان، عاطفه خداکرمی، خسرو خواجه، بهاره دبیرمنش،
جلد ۲۶، شماره ۱۰ - ( ۱۰-۱۳۹۸ )
چکیده
زمینه و هدف: متوتروکسات یکی از داروهای پرمصرف در شیمی درمانی است که نارسایی کلیوی یکی از عوارض جانبی آن است. آنزیم کربوکسی پپتیدازG۲ (گلوکارپیداز تحت نام تجاری وراکساز) آنزیمی باکتریایی است که میتواند متوتروکسات را به متابولیت‌های غیرفعال خود تبدیل کند و پس از درمان با دز بالای متوتروکسات، منجر به حذف آن از مسیر غیرکلیوی می‌شود.
روش کار: در این پروژه ابتدا ژن کربوکسی پپتیداز G۲ به دست آمده از سایتNCBI (Accession number: ACY۰۵۵۱۷) در داخل وکتور pUC۵۷ توسط شرکتGene Cust سنتز شد ,سپس برای ادامه روند، وکتور pUC۵۷ که حاوی ژن کربوکسی پپتیداز G۲ بود از باکتری استخراج شد و به عنوان الگو در واکنش PCR به همراه پرایمرهای دارای سایت برشNdeI و XhoIمورد استفاده قرار گرفت. پس از آن بر روی محصولPCR هضم آنزیمی صورت گرفت و در بین سایت‌های مورد نظر در وکتور بیانی pET۲۸a کلون گردید. در نهایت پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی E. coli BL۲۱ ترنسفورم شد و تعدادی از پلاسمیدهای تایید شده از طریق Colony PCR برای تعیین توالی با پرایمر T۷ promotor و T۷ terminator، ارسال شدند. نتایج تعیین توالی نیز حضور ژن را تایید کردند، پس از آن بیان تحت شرایط بیانی مختلف بهینه گردید.
یافته‌ها: بیشترین سطح بیان در غلظت ۵/۰ میلی مولار IPTG دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و مدت زمان انکوباسیون ۶ ساعت تعیین شد. در انتها پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز تخلیص و ویژگی های سینتیکی آن بررسی شد. pH و دمای بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب ۷ و ˚C۲۵ به دست آمد. برای سوبسترای متوتروکسات μM ۲۴Km= و μmol/min ۰۰۵۴۳۱/۰ Vmax = محاسبه شد.
نتیجه‌‌گیری: این مطالعه به منظور تولید و فرآوری آنزیم کربوکسی پپتیداز G۲ بوده و در آینده این آنزیم میتواند کاندیدای بالقوه ای برای کاهش اثرات جانبی شیمی درمانی باشد.
