مجله علوم پزشکی رازی

    زمینه و هدف: بیماری توکسوپلاسموزیس توسط تک یاخته انگلی به نام توکسوپلاسماگوندی(Toxoplasma gondii) ایجاد می‌شود.SAG۱(Surface Antigen ۱)، آنتی‌ژن اختصاصی ـ مرحله‌ای است که فقط در مرحله تاکی زوئیت وجود دارد و در مراحل اسپوروزئیت و برادی زوئیت وجود ندارد و به مقدار فراوان و به طور یکنواخت بر روی سطح داخل و خارج سلولی تاکی‌زوئیت‌ها توزیع شده است. این آنتی‌ژن دارای دو گلیکوفرم است و آنتی‌ژن، کاملاً conformational است. ژن کد کننده SAG۱، به صورت Single copy بوده و هیچ اینترونی ندارد. SAG۱، ایمونوژنیک‌ترین ساختار تاکی‌زوئیت T.gondii است و به همین خاطر در چندین روش تشخیصی و برای تهیه واکسن نوترکیب و زیر واحدی علیه بیماری توکسوپلاسموزیس، استفاده شده و مورد توجه بوده است. هدف از این مطالعه، کلون کردن قطعه SAG۱ در پلاسمید PTZ۵۷R و ترانسفورم کردن پلاسمید نوترکیب در سویه‌های DH۵α و TG۱ باکتری‌های E.coli می‌باشد. روش بررسی: این تحقیق یک مطالعه تجربی می‌باشد. برای این کار، ابتدا انگل توکسوپلاسما در صفاق موش سوری تکثیر داده و آنگاه انگل با PBS(Phosphate buffered saline) شستشو داده شد. جهت تهیه و نگهداری انگل، از موش سوری ماده استفاده شد. DNA(Deoxyribonucleic acid) ژنومی توکسوپلاسما، با روش فنل ـ کلر فرم، استخراج شده، سپس با کمک پرایمرهای اختصاصی ویژه ژن SAG۱، ژن مورد نظر با روش PCR(Polymrase chain reaction) تکثیر شد و با استفاده از ژل آگاروز، محصول PCR، الکتروفورز شده و اندازه ژن تکثیر شده با استفاده از مارکر تعیین شد. محصول PCR با استفاده از کیت تجارتی، خالص شده و سپس به کمک آنزیم T۴DNA Ligase، محصول PCR به داخل یک کلونینگ وکتور کلون شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب به داخل سلولهای مستعد E.coli دو سوش TG۱ و DH۵α ترانسفورم شد. یافته‌ها: نمونه DNA خالص سازی شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن SAG۱، PCR گردید. محصول PCR به صورت یک باند bp۹۶۰(۹۶۰ جفت باز) در ژل آگاروز ۱% مشاهده گردید. محصول PCR درون پلاسمید PTZ۵۷R، کلون گردید، سپس پلاسمید نوترکیب درون باکتری اشرشیاکلی سوش‌های TG۱، DH۵α ترانسفورم گردید. برای شناسایی پلاسمید نوترکیب، ابتدا به کمک ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک، کلونی‌های حاوی پلاسمید نوترکیب روی محیط LB جامد حاوی XGAL(۵- bromo-۴ chloro-۳ indolyl beta diGalactopyranosid)، IPTG(Isopropyl-beta-dithio Galactopyranosid) و آمپی‌سیلین جداسازی گردیدند، سپس پلاسمید نوترکیب استخراج شد و با روش PCR، ژن مورد نظر تایید گردید. پلاسمید نوترکیب حاوی ژن SAG۱ تحت تاثیر برش آنزیمی قرار گرفت که قطعات bp۲۹۸۲ و bp۸۶۴ بدست آمده نیز نشانه تایید کار می‌باشد. کلونی‌های TG۱ و DH۵α که در محیط LB رشد کرده بودند، شمارش گردیدند و میانگین و انحراف معیار برای این دو سویه در هر پلیت براساس آزمون آماری Mannwhitny مقایسه گردید. نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد که پلاسمید PTZ۵۷R و استرین TG۱ اشرشیاکلی بکار رفته در این تحقیق، برای نگهداری ژن SAG۱ مناسب می‌باشند.