fa استخراج و بهینه‌سازی تخلیص چند مرحله‌ای آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین I(ACE) از ریه خرگوش بیوشیمی Biochemistry پژوهشي Research     آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین I(ACE) یک پپتیدیل دی پپتید هیدرولاز است که 2 اسید آمینه انتهای کربوکسیلی(His-Leu) را از آنژیوتانسین I که یک دکاپپتید است جدا کرده و آنژیوتانسین II(یک اکتاپپتید) را تولید می‌نماید. به علت اهمیت ACE و مهارکننده‌های آن در بیماری‌زایی و درمان بیماری‌های قلبی عروقی مانند فشار خون بالا و نارسایی قلبی، تخلیص و سنجش آن علاوه بر ارزش علمی دارای اهمیت‌ بالینی و تجاری می‌باشد. با توجه به این مطلب، در مطالعه حاضر ACE از بافت ریه خرگوش به عنوان منبــع غنـی از ACE در 3 مرحله خالص گردید. برای استخراج ACE، پس از عمل هموژن کردن، از دترژنت غیریونی 40P-Nonidet استفاده شد سپس محلول استخراج شــده از دترژنــت، تحــت عمل رسوب‌دهی با سولفات آمونیوم با غلظت‌های اشباعی 50% و 70% قرار گرفــت. در مرحلــه بعــد محلول رویی به دست آمده توسط تبادل یونی با Q-Sepharose HP کروماتوگرافی شد سپس نمونه‌های دارای حداکثر فعالیت مخصوص آنزیم، توسط 200Sepharryl HR S تحت کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون قرار گرفتند. پس از این مرحله خالص بودن آنزیم با SDS-PAGE و PAGE تایید شد و وزن مولکولی آن 175 کیلودالتون تعیین گردید. فعالیت مخصوص نهایی به دست آمده برای ACE، 1/39 واحد در میلی‌گرم بود که به دنبال 651 برابر خالص‌کردن حاصل شده بود و بازده نهایی فرآیند تخلیص، 2/5% مشاهده شد. پس از تخلیص آنزیم، Km(michaelis constant) آن برای سوبسترای HHL(هیپوریل ـ هیستیدیل ـ لوسین)، 17/2 میلی‌مول محاسبه شد. مهار کننــده رقابتــی کاپتوپریــل توانست در غلظت‌های 1/0 تا 001/0 میلی مولار تقریباً ACE را به طور کامل مهار کنــد. PH اپتیمم برای ACE 3/8 محاسبه گردید. هم‌چنین بررسی اثر تغییرات دمایی، کاهش شدیــد در فعالیت آنزیم را در دمای بالاتر از 37 درجه سانتی‌گراد نشان داد. کاهش مراحل تخلیص و مــدت زمان لازم برای آن و نیز بازده مناسب به دست آمده، نتیجـه استفاده از رزین‌های با قدرت تفکیــک بهتـر و به کار گیـری سیستم FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) بود که در نهایت موجب بهبود و کاهش زمان فرآیند تخلیص چند مرحله‌ای ACE گردید. <br> Angiotensin-converting enzyme(ACE)(EC: 3.4.15.1) is a peptidyl dipeptide hydrolase that removes the carboxyl terminal (His-Leu) from angiotensin I to produce the octapeptide angiotensin II. Due to the importance of ACE and its active site-directed inhibitors in the pathogenesis and treatment of cardiovascular disorders such as hypertension and heart failure, ACE purification and assay are of clinical and commercial as well as scientific interest. In the present study it was attempted to purify ACE faster and simpler. Purification procedure was finally performed in three steps. After homogenization and centrifugation, ACE was solubilized from pellet using Nonidet-P40, a non-ionic detergent. The supernatant solution brought to 50% and 70% saturation concentration of ammonium sulfate. After ammonium sulfate precipitation, the supernatant solution was used to purify ACE by Q-Sepharose HP as a strong anion exchanger and then by Sephacryl HR S200(gel filtration). After these steps, ACE purification was confirmed by PAGE and SDS-PAGE. The molecular weight found for ACE was 175 KD. Final specific activity was 39.1 units/mg which was achieved through 651 fold purification and the activity recovered was 5.2%. After purification, Km of ACE for Hippuryl-Histidyl-Leucine, a synthetic substrate, was 2.17 mM. Concentrations between 0.001-0.1mM of Captopril, a competitive inhibitor, inhibited ACE almost completely. Optimal pH determined for ACE activity was 8.3. Incubation temperature above 37˚c decreased ACE activity remarkably. ACE purification in three steps(previously often in 5 steps), a decrease in purification steps, procedure time and expenditure and also acceptable activity and yield, were all due to using resins with high resolution and also FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system which, finally, facilitated the chromatographic procedures. ،1 – آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین ،2 – تخلیص چند مرحله‌ای،3 – کروماتوگرافی ، 4 – ریه Key Words: 1) Angiotensin Converting Enzyme 2) Multi-Step Purification 979 985 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-123&slc_lang=fa&sid=1 S.M Shafiee سیدمحمد شفیعی 3900319475328460015437 3900319475328460015437 No M Keyhani مهیندخت کیهانی 3900319475328460015438 3900319475328460015438 Yes M Shabani محمد شعبانی 3900319475328460015439 3900319475328460015439 No I Koochaki Shalmani اسماعیل کوچکی شلمانی 3900319475328460015440 3900319475328460015440 No M Kaviani مهرانگیز کاویانی 3900319475328460015441 3900319475328460015441 No