fa کلونینگ و بیان دو ژن مهار کننده متالوپروتئیناز عقرب همیسکور پیوس لپتوروس ( عقرب خطرناک خوزستان ) بیولوژی (زیست شناسی) Biology پژوهشي Research <strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف: </span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یکی از خطرناک‌ترین گون‌های عقرب بومی ایران <em>همیسکورپیوس لپتوروس</em> می‌باشد که زهر آن بسیار سمی و مسئول بیشتر مرگ و میر‌های ناشی از گزش عقرب در ایران است. چهار مهارکننده متالوپروتئیناز (</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">HLMetInhibit1-4</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">) در زهر این عقرب یافت می‌شود. مهارکننده‌های متالوپروتئیناز از مهم‌ترین پروتئین‌های دخیل در بسیاری از فرایندهای سلولی مانند بقای ماتریکس خارج سلولی می‌باشند. هدف از این مطالعه، بررسی ساختار و ویژگی‌های دو مورد از این مولکول‌ها و در ادامه کلونینگ و بیان آن‌ها برای اولین بار می‌باشد.</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></span><br> <strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">روش کار:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> مطالعات بیوانفورماتیکی و داکینگ مولکولی روی توالی‌های </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">HLMetInhibit1</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">HLMetInhibit2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> (با شماره دسترسی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">MG764541</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">MG764542</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">NCBI</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">)، صورت پذیرفت. پلاسمیدهای نوترکیب </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">(pET-22b- HLMetInhibit1,2)</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> پس از طراحی و سنتز، به میزبان</span></span></span> <em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">E. coli </span></span></span></span></em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">BL21</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> منتقل شدند، </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Colony-PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و الکتروفورز روی ژل آگاروز 1 درصد انجام گردید و القا بیان پروتئین‌ها در غلظت‌های متفاوت </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و زمان‌های مختلف صورت گرفت. سپس </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-PAGE</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و رنگ</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">آمیزی با کوماسی بلو و لکه گذاری وسترن انجام شد.</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></span><br> <strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته‌ها:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> نتایج داکینگ تمایل اتصالی بیشتری را برای </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">HLMetInhibit1</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> پیش‌بینی می‌کرد. کلونینگ ژن‌ها صورت گرفت. بیشترین میزان بیان پس از 5 ساعت و در غلظت 1 میلی مولار </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> مشاهده گردید. صحت بیان پروتئین‌های </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">HLMetInhibit1</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;HLMetInhibit2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با وزن‌های مولکولی 26 و 17 کیلو دالتون پس از </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-page</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و لکه گذاری وسترن تایید شد.</span></span></span><br> <strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه‌گیری:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> کلونینگ و بیان ژن مهارکننده‌های متالوپروتئیناز 1 و 2 عقرب <em>همیسکورپیوس لپتروس</em> به عنوان پروتئین‌هایی نوین که تا کنون مورد بررسی قرار نگرفته‌اند انجام پذیر می‌باشد و امید است پس از انجام آزمایشات آتی </span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">in vitro</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">in vivo</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> بتوان به کاندیدی مناسب برای تحقیق در زمینه‌های مختلف درمانی دست یافت.</span></span></span><br> &nbsp; <p class="EndNoteBibliographyTitle" style="line-height:115%"><strong>Background:</strong> One of the most dangerous endemic scorpions of Iran is <em>Hemiscorpius lepturus</em> that its venom is very toxic and known as responsible for most of scorpion sting dependent deaths in Iran. There are four Metalloproteinase inhibitors in the venom gland transcriptome of this scorpion (HLMetInhibit1-4). Metalloproteinase inhibitors are involved in some of the critical cells activity including the stability and surviving of ECM. This study aimed to investigate the structure and functions of a pair of these molecules and subsequently their cloning and expression for the first time.<br> <strong>Methods:</strong> Bioinformatics analysis and molecular docking on sequences of HLMetInhibit1 and HLMetInhibit2 performed (with the MG764541 and MG764542 NCBI accession numbers). The recombinant plasmids (pET-22b- HLMetInhibit 1,2) designed and synthesized, then transformed into the <em>E. coli</em> BL21 bacterial host. The colony-PCR and electrophoresis on one percent agarose gel performed and protein expression induced by different concentrations of IPTG at different times. Then SDS-PAGE and staining by coomassie brilliant blue and western blotting performed.<br> <strong>Results:</strong> The highest binding affinity predicted for HLMetInhibit1 by molecular docking results. Gene cloning performed. Highest protein expression detected after 5 hours and with 1 mM concentration of IPTG. SDS-PAGE and western blotting confirmed the protein expression correctness for HLMetInhibit1 and HLMetInhibit2 with 26 and 17 KD of molecular weights.<br> <strong>Conclusion:</strong> Gene cloning and protein expression of <em>Hemiscorpius lepturus</em> metalloproteinase inhibitors 1 and 2 as the novel proteins that have not been studied so far, is approachable and it is hoped that after further <em>in vitro</em> and <em>in vivo</em> investigations, they will be the suitable candidates for research in the Various therapeutic fields.</p> کلونینگ و بیان , سرطان , مهار کننده متالوپروتئیناز, همیسکورپیوس لپتوروس Cloning and Expression, Cancer, Hemiscorpius lepturus, Metalloproteinase inhibitors 9 19 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2702-3&slc_lang=fa&sid=1 Mahrdad Ahadi مهرداد احدی 3900319475328460048174 3900319475328460048174 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران Mahdi Behdani مهدی بهدانی 3900319475328460048175 3900319475328460048175 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران Delavar Shahbazzadeh دلاور شهباززاده 3900319475328460048176 3900319475328460048176 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران Fatemeh Kazemi-Lomedasht فاطمه کاظمی لمعه دشت fa_kazemi@pasteur.ac.ir 3900319475328460048177 3900319475328460048177 Yes Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران