fa همسانه سازی و بیان ژن مولد پپتید AcAMP از قارچ Aspergillus clavatus در باکتری E. coli و بررسی تیتر آنتی بادی آن در موش سوری ایمنی‌شناسی Immunology پژوهشي Research <strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف</span></span></strong>: <span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">پپتیدهای ضد میکروبی به عنوان منادی تغییر آنتی بیوتیک‌های امروزی مورد توجه قرار گرفته‌اند. پپتید ضد میکروبی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">AcAMP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> یکی از این موارد بوده که از قارچ رشته‌ای </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ES1</span></span></span></span> <em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Aspergillus clavatus</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> تخلیص و خواص بیوشیمیایی آن بررسی گردیده و مشخص شد که این پپتید دارای خواص منحصر بفردی می‌باشد. هدف این مطالعه، بیان ژن مولد پپتید </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">AcAMP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در باکتری </span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">E. coli</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و بررسی تیتر آنتی بادی آن در موش می‌باشد.</span></span></span><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></strong><br> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">روش کار</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">: در این مطالعه تجربی ژن مولد پپتید </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">AcAMP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با جایگاه‌های آنزیمی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">BamHI</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SalI</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> از پلاسمید </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pUC57</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با استفاده از </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، </span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">تکثیر و در وکتور بیانی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pET28a(+)</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> همسانه‌سازی و به باکتری اشریشیا کولی&nbsp; &nbsp;سویه </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">BL21(DE3)</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> تراریخت شد. بیان پروتئین نوترکیب </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">AcAMP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> القاء و به وسیله کروماتوگرافی تمایلی نیکل تخلیص گردید. به منظور تأیید پروتئین نوترکیب </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">western blotting</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> انجام گرفت. موش‌ها به صورت صفاقی با پروتئین تخلیص شده ایمن شدند و تیتر </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IgG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> سرم به روش </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ELISA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> مورد سنجش قرار گرفت.</span></span></span><br> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته‌ها</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">: عمل همسانه‌سازی در وکتور بیانی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pET28a(+)</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> به وسیله واکنش </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و توالی یابی تائید گردید. پروتئین نوترکیب 9 کیلودالتونی تولید شده به وسیله </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-PAGE</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و لکه‌گذاری وسترن مورد تأیید قرار گرفت. روند تولید آنتی بادی با استفاره از الایزا غیر مستقیم نشان دهنده ی روند افزایشی آنتی بادی مخصوصاً پس از تزریق چهارم می‌باشد.</span></span></span><br> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه گیری</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">: از پپتید </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">AcAMP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> نوترکیب تخلیص شده و آنتی بادی تولید شده می‌توان در تحقیقات ضد میکروبی اعم از بررسی عملکرد ضد میکروبی پپتید نوترکیب و شناسایی پپتید در کاربرد های مختلف</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">استفاده نمود.</span></span></span> <strong>Background</strong>: Antimicrobial peptides have been considered as the key to change in the current antibiotics. AcAMP, Antimicrobial peptide is one of them, which has been purified from the <em>Aspergillus clavatus</em> ES1 fungus, and its biochemical properties and characterization indicate that this peptide has unique properties. The aim of this study was to express the gene of AcAMP peptide in <em>Escherichia coli</em> (<em>E. coli)</em> and investigate its antibody titration in mice.<span dir="RTL"></span><br> <strong>Methods</strong><span dir="RTL">:</span> In this experimental study, the AcAMP peptide-producing gene with BamHI and SalI enzymes was amplified from pUC57 containing gen using PCR and cloned to pET28a expression vector (+) and transformed into <em>E. coli</em> strain BL21 (DE3) in the next step. The expression of the AcAMP recombinant protein was induced by IPTG and purified by the affinity Ni-NTA chromatography. The recombinant protein was confirmed using Western blotting. Mice were intraperitoneally immunized with purified protein, and IgG titration was measured by ELISA method.<span dir="RTL"></span><br> <strong>Results</strong><span dir="RTL">:</span> The recombinant pET28a (+) expression vector was confirmed by PCR and sequencing. The 9 kDa produced protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Antibody production process, using indirect ELISA, indicates the increasing trend of antibodies titration, especially after the fourth injection.<span dir="RTL"></span><br> <strong>Conclusion</strong><span dir="RTL">:</span> Purified recombinant AcAMP peptide and produced antibody can be used in antimicrobial research such as antimicrobial activity characterization of recombinant peptide and peptide identification in various applications<span dir="RTL">.</span><br> &nbsp; قارچ آسپرژیلوس کلواتوس, پپتیدهای ضد میکروبی, پپتید AcAMP, موش آزمایشگاهی, تیتر آنتی بادی Aspergillus clavatus, antimicrobial peptides, AcAMP peptide, laboratory mice, Antibody titration 9 18 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3495-2&slc_lang=fa&sid=1 احسان زمانی meshkat110@chmail.ir 3900319475328460040760 3900319475328460040760 No دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران. جمیل زرگان jazrgan@ihu.ac.ir 3900319475328460040761 3900319475328460040761 No دانشگاه جامع امام حسین (ع)- مرکز علم و فناوری زیست شناسی حسین هنری honari.hosein@gmail.com 3900319475328460040762 3900319475328460040762 Yes Imam Hossein Comprehensive University, Tehran, Iran دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران