Razi Journal of Medical Sciences
مجله علوم پزشکی رازی
RJMS
Medical Sciences
http://rjms.iums.ac.ir
39
journal39
2228-7043
2228-7051
en
jalali
1398
9
1
gregorian
2019
12
1
26
10
online
1
fulltext
fa
کلون، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم کربوکسی پپتیداز G2
Cloning, expression and Characterization of Carboxypeptidase G2 Enzyme from E.coli
بیوشیمی بالینی
Clinical Biochemistry
پژوهشي
Research
<strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف: </span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">متوتروکسات یکی از داروهای پرمصرف در شیمی درمانی است که نارسایی کلیوی یکی از عوارض جانبی آن است. آنزیم کربوکسی پپتیداز</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">G2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> (گلوکارپیداز تحت نام تجاری وراکساز) آنزیمی باکتریایی است که میتواند متوتروکسات را به متابولیتهای غیرفعال خود تبدیل کند و پس از درمان با دز بالای متوتروکسات، منجر به حذف آن از مسیر غیرکلیوی میشود. </span></span></span><br>
<strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">روش کار:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در این پروژه ابتدا ژن کربوکسی پپتیداز </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">G2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> به دست آمده از سایت</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">NCBI </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> (</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Accession number:</span></span></span></span> <span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ACY05517</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">) در داخل وکتور </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pUC57</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> توسط شرکت</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Gene Cust </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> سنتز شد</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> ,</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">سپس</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">برای ادامه روند، وکتور</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> pUC57</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> که حاوی ژن کربوکسی پپتیداز </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">G2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> بود از باکتری استخراج شد و به عنوان الگو در واکنش </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> به همراه پرایمرهای دارای سایت برش</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">NdeI </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> XhoI</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">مورد استفاده قرار گرفت.</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">پس</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> از آن بر روی محصول</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> هضم آنزیمی صورت گرفت و در بین سایتهای مورد نظر در وکتور بیانی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pET28a</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> کلون گردید. در نهایت پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی </span></span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">E. coli</span></span></span></span></em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> BL21</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> ترنسفورم شد و تعدادی از پلاسمیدهای تایید شده از طریق </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Colony PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> برای تعیین توالی با پرایمر </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">T7 promotor</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">T7 terminator</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، ارسال شدند. نتایج تعیین توالی نیز حضور ژن را تایید کردند، پس از آن بیان تحت شرایط بیانی مختلف بهینه گردید.</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></span><br>
<strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یافتهها:</span></span></span></strong><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> بیشترین سطح بیان در غلظت 5/0 میلی</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">مولار </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> دمای 25 درجه سانتیگراد و مدت زمان انکوباسیون 6 ساعت تعیین شد. در انتها پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز تخلیص و ویژگی های سینتیکی آن بررسی شد. </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> pH</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و دمای بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب 7 و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">˚C</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">25 به دست آمد.</span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">برای سوبسترای متوتروکسات </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">μM</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> 24</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">K<sub>m</sub>= </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"> μmol/min</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> 005431/0 </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">V<sub>max</sub> =</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> محاسبه شد.</span></span></span><br>
<strong><span style="color:#0070c0;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجهگیری:</span></span></span></strong> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">این مطالعه به منظور تولید و فرآوری آنزیم کربوکسی پپتیداز </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">G2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> بوده و در آینده این آنزیم میتواند کاندیدای بالقوه ای برای کاهش اثرات جانبی شیمی درمانی باشد.</span></span></span>
<strong>Background:</strong> Methotrexate is one of the most widely used chemotherapeutic agents that may cause kidney failure as a side effect. Carboxypeptidase G2 (Glucarpidase marketed under the brand name of Voraxaze) is a bacterial enzyme that can convert methotrexate to its inactive metabolites and provides an alternative non-renal pathway for methotrexate elimination in patients with renal dysfunction during high-dose methotrexate treatment.<br>
<strong>Methods: </strong>In this research, carboxypeptidase G2 was synthetized in pUC 57 vector. Then it was subcloned into pET28a between NdeI and XhoI restriction sites. Recombinant vector was transformed into <em>E. coli</em> BL21 and its expression was examined in various conditions. <br>
<strong>Results:</strong> The optimum expression of recombinant protein was obtained at the concentration of 0.5 mM IPTG, 25 ° C, 6 h. Then the active enzyme was purified by Nickle affinity chromatography. Optimal pH and temperature of enzyme was 7 and 25 ˚C respectively. The K<sub>m </sub>and V<sub>max</sub> for methotrexate were 24 µM and 0.005431 µmol/min. <br>
<strong>Conclusion:</strong> The present study was conducted to produce recombinant carboxypeptidase G2 and to improve its production efficiency. In future, this enzyme could be a potential candidate for preventing chemotherapy side effects.<br>
وراکساز, متوتروکسات, داروی نادر, کلونینگ, کربوکسی پپتیداز G2
Voraxaze, Methotrexate, Orphan Drug, Cloning, Carboxypeptidase G2
8
18
http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3831-1&slc_lang=fa&sid=1
Reza
Aali zade
رضا
عالی زاده
3900319475328460088809
3900319475328460088809
No
دانشگاه تربیت مدرس
Nasrin
Kardan
نسرین
کاردان
3900319475328460088810
3900319475328460088810
No
دانشگاه تربیت مدرس
Atefeh
Khodakarami
عاطفه
خداکرمی
3900319475328460088811
3900319475328460088811
No
دانشگاه تربیت مدرس
Khosro
Khajeh
خسرو
خواجه
3900319475328460088812
3900319475328460088812
No
دانشگاه تربیت مدرس
Bahareh
Dabirmanesh
بهاره
دبیرمنش
dabirmanesh@modares.ac.ir
3900319475328460088813
3900319475328460088813
Yes
Tarbit Modares University, Tehran, Iran
دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران