fa ارزیابی و مقایسه تیتر آنتی بادی علیه پروتئین های نوترکیب منفرد، مخلوط و کایمر CTXB، TCPA وTCPA CTXB- میکروبیولوژی Microbiology پژوهشي Research <strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">زمینه و هدف</span></span></strong>: <span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">وبا به عنوان بیماری اسهالی یکی از مهم‌ترین علل مرگ و ناتوانی در افراد جوامع مختلف به شمار می‌رود. فاکتور کلونیزاسیون پیلی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">tcpA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp; و توکسین کلرا مهم‌ترین فاکتورهای بیماری‌زایی ویبریوکلرا می‌باشند. زیر واحد </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">B</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> سم کلرا (</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ctxB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">) و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">tcpA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> توانایی القای پاسخ های ایمنی را دارند. ﻫﺪف از ایﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ، ﺗﻮﻟﯿﺪ پروتئین های نوترکیب </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB-TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و مطالعه ایمنی زایی و مقایسه تیتر آنتی بادی کایمر، مخلوط و جداگانه پروتئین ‌ها‌ی نوترکیب در موش بود.</span></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">روش کار</span></span></strong>: <span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">در این مطالعه تجربی، ژن های</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ctxB </span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">،</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">tcpA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و کایمر </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ctxB-tcpA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در وکتورهای بیانی (+) </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pET28a</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و (+) </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pET32a</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> همسانه سازی و پلاسیمدهای نوترکیب به </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">coli BL21 DE3</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">. </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">E</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> منتقل شدند. بیان پروتئین های نوترکیب با </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> القا و با روش </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-PAGE</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و وسترن بلاتینگ بررسی شد. جهت تخلیص پروتئین نوترکیب از کروماتوگرافی تمایلی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Ni-NTA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> استفاده شد. ایﻤن سازی موش‌ها ﺑﻪ روش درون صفاقی و زیر پوستی انجام شد. ﺗﯿﺘﺮ آنتی‌بادی در سرم موش های ایمن شده ﺑﺎ روش اﻻیﺰا ﻣﻮرد ارزیﺎﺑﯽ ﻗﺮار گرفت.</span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته‌ها</span></span></strong>: <span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">آنالیز </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS PAGE</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و وسترن بلاتینگ، بیان و تخلیص پروتئین های نوترکیب را تائید کرد. میزان پروتئین های خالص شده </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB-TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> به ترتیب 570/15، 533/11 و 100/33 میلی گرم در لیتر بود. نتایج الایزا نشان داد که ایمنی‌زایی موش ها به خوبی صورت پذیرفته است. تفاوت معنی داری در تیتر آنتی بادی علیه آنتی ژن ‌ها‌ی </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB-TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و مخلوط </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">TCPA</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با </span></span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> وجود نداشت. همچنین ﺗﻔﺎوت معنی‌داری در ﺗﯿﺘﺮ آنتی‌بادی‌ حاصل از تزریق درون صفاقی و زیرپوستی مشاهده نشد.</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه‌گیری</span></span></strong><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">: اﺧﺘﻼف جزئی در ﺗﯿﺘﺮ آنتی‌بادی پروتئین‌ها ﻣﻤﮑﻦ اﺳﺖ ﺑﻪ ﻃﻮل ﻋﻤﺮ سلول‌های ﺧﺎﻃﺮه ﺣﺎﺻﻠﻪ در ایﻦ گروه‌ها و همچنین روش تزریقی آن‌ها ارﺗﺒﺎط داشته باشد. با توجه به مزیت های پروتئین های کایمر، </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CTXB-TCPA</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> می تواند جایگزین مناسبی برای مخلوط پروتئین ها جهت تحریک سیستم ایمنی باشد.</span></span><br> &nbsp; <strong>Background</strong>: Cholera as diarrheal illness is one of the most important causes of death and people&#39;s disability in different societies. Colonization factor pili (tcpA) and cholera toxin are the most important factors in the pathogenesis of Vibrio Cholera. B subunit of cholera toxin (ctxB) and tcpA have the ability to induce immune responses. The aims of this study was production of CTXB, TCPA, CTXB-TCPA recombinant protein and evaluation of antibody titers against separately, cocktail and chimeric protein in mice.<br> <strong>Methods</strong>: In this research study, ctxB <span dir="RTL">،</span>tcpA and ctxB-tcpA genes were cloned in pET28a and pET32a vectors. Recombinant plasmids was transformed to Escherichia coli (E.coli) BL21 DE3 and expression was induced with IPTG. The protein expression were evaluated by SDS-PAGE and Western Blotting analysis. The recombinant proteins were purified using Ni&ndash;NTA affinity chromatography. Mice immunization were done subcutaneously or intraperitoneally. Antibody titer was determined by ELISA in immunized mice sera.<br> <strong>Results</strong>: SDS PAGE and western blotting confirmed expression and purification of recombinant proteins. The yield of purified CTXB, TCPA, CTXB-TCPA proteins was 15/570, 11/533 and 33/100 mg/L, respectively. ELISA results showed satisfactory immunization of mice.<br> There was no significant difference in antibody titers against CTXB-TCPA protein and CTXB, TCPA cocktail. Also, no significant difference was observed in titers between subcutaneously or intraperitoneal injection.<br> <strong>Conclusion</strong>: The low differences in the antibody titer may be related to the longevity of memory cells and also their injection method. Due to the advantages of chimeric proteins, CTXB-TCPA protein could be a good alternative instead of protein cocktail to stimulate the immune system. ویبریو کلرا, ctxB, tcpA , پروتئین کایمر, تیترآنتی بادی Vibrio cholera , ctxB, tcpA, Chimeric recombinant, Antibody titer 80 91 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3652-1&slc_lang=fa&sid=1 Milad Amerian میلاد عامریان m.amerianbio@gmail.com 3900319475328460038557 3900319475328460038557 No Imam Hossain University, Tehran, Iran. دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران. Shahram Nazarian شهرام نظریان nazarian56@gmail.com 3900319475328460038556 3900319475328460038556 Yes Imam Hossain University, Tehran, Iran. دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران.