Razi Journal of Medical Sciences

fa ایجاد یک روش نوین آزمایشگاهی الایزا توبی (ToBi Assay) برای تعیین پوتنسی واکسن بومی توکسوییدی کزاز درایران Development of ELISA (TOBi) assay for determination of Tetanust toxoid potency ایمونولوژی Immunology پژوهشي Research زمینه و هدف: یکی از کاربردهای اصلی استفاده از حیوانات آزمایشگاهی به روش in vivo در مراکز تولید واکسن در  تست های کنترل کیفی (کارائی: Potency) است که اخیرا به دلیل مشکلات خاص در استفاده از حیوانات آزمایشگاهی جایگزینی این آزمون به روش in vitro  ارائه شده است. تست مهار سازی اتصال توکسین (Toxin Binding Inhibition - ToBi‌‌) یکی از این روش ها است که بر مبنای مهار اتصال توکسین به آنتی توکسین متصل به پلیت الایزا است. از اهداف اصلی در این پژوهش بررسی روش فوق برای تعیین کارایی توکسوئید کزاز و مقایسه آن با آزمون خنثی سازی سرم (Serum Neutralization Test, SN) است. جایگزین نمودن استفاده از آزمون الایزا (in vitro) بجای استفاده از آزمون‌های چالش challenge و یا آزمون خنثی سازی سرم (SN) در کنترل کیفی واکسن کزاز، و جایگزینی این روش به عنوان یک روش استاندارد و پیشنهاد شده توسط  کمیسیون اروپایی فارماکوپه و WHO، از اهداف مهم پژوهش حاضر است. روش کار: در این روش گروهی از موش های آزمایشگاهی نژاد (NIH) را بوسیله رقت های مناسب از واکسن تولید موسسه رازی و واکسن مرجع توکسوئید کزاز (NIBSC) ایمن نموده و پس از خون گیری و جداسازی سرم، عیار واکسن (کارایی) به روش الایزا (in vitro) سنجیده شد. برای انجام آزمون خنثی سازی سرم (SN) نیز خوکچه‌های هندی  را با نیمی از دز مورد استفاده در مطالعات انسانی ایمن نموده و جهت انجام تست ToBi‌‌ رقت های مختلف از سرم تهیه شد که با مقادیر متفاوتی از توکسین کزاز مجاور گردید. مخلوط حاصل پس از طی دوره نگهداری در گرمخانه 37 درجه سلسیوس، در پلیت الایزا کد شده وبا آنتی تتانوس ایمونوگلوبینHorse anti tetanus IgG)   ( اسبی منتقل ,با افزودن Anti T IgG، نشاندار شده با HRP، میزان توکسین آزاد سنجیده شد. یافته‌ها: نتایج بدست آمده از روش مهار سازی اتصال توکسین (ToBi) با روش SN مقایسه گردیدند. دامنه نتایج  عیار توکسوئید کزاز از  IU/ml 8/1-3/5 متغیر بودند. با استفاده ازروش آزمون آماری Parallel line analysis این نتایج اختلاف معنی داری را نشان ندادند (05/0p<). نتیجه‌گیری: نتایج حاصل  نشان داد که استفاده از این روش امکان ارزیابی واکسن های با عیار پائین راهم ممکن می سازد. در نتیجه می توان این روش را نسبت به آزمون های معمول مانند خنثی سازی سرم و آزمون چلنج واکسن (Challenge Test) دارای مزایای بیشتری از جمله کاهش استفاده از حیوانات آزمایشگاهی، ملاحظات اخلاقی و صرفه جوئی در زمان و هزینه دانست.    Background: One of the major uses of large number of laboratory animals in manufacturing the vaccines is the quality control testing of vaccines, particularly potency testing of vaccines containing the tetanus toxoids by either lethal challenge or serum neutralization tests. Recently, because of various difficulties to obtain quality laboratory animals and in adequate environmental conditions, a lot of efforts have been made (such as those of World Health Organization’s) to attempt to limit the use of animals (in vivo) in the research in routine quality control of human and veterinary vaccines by in vitro assays such as Toxin Binding Inhibition (ToBi) assay. ToBi assay is based on the inhibition of the binding of toxin to an antitoxin-coated ELISA plate which detects the free toxin into the toxin-serum mixtures. In this study we tried to demonstrate and setting up the parameters of ToBi assay for the tetanus toxoid potency determination compared with serum neutralization test. Methods: Groups of mice were immunized with several of dilutions of reference or test tetanus toxoid vaccines and groups of guinea pigs were also immunized (for Serum Neutralization test) with the dose of half of total human dose of tetanus toxoid vaccines manufactured by Razi Vaccine & Serum Research Institute. Serum samples were pooled and titrated for levels of tetanus antitoxin by toxin binding inhibition (ToBi) test and by the serum neutralization (SN) test in mice. The ToBi test was carried out by making of Serum dilutions and a fixed amount of tetanus toxin added to each serum dilution. After incubation, the mixtures were transferred on to ELISA plate coated with purified equine anti-tetanus IgG. Then free toxin is detected by addition of HRP labelled equine anti-tetanus IgG. Results: The results were shown to be significantly correlated. The consistency between the ToBi test derived from the in vitro data and from the in vivo data were reliable. The results ranged from 1.8 to 5.3 IU/ml for tetanus toxoid vaccines by ToBi test and 3.3 to 6 IU/ml for tetanus toxoid vaccines by SN in mice. The ToBi test may able to distinguish between highly potent and less potent vaccines. Conclusion:  It is concluded that the ToBi test is an alternative to the in vivo neutralization procedure in the immunogenicity test of the tetanus component in adsorbed vaccines. A substantial refinement and a reduction in use of animals can be achieved. The ToBi test offers distinct advantages in relationship to serum neutralization in mice and lethal challenge tests.   آزمون مهار سازی اتصال توکسین (ToBi) , واکسن بومی کزاز, آزمون خنثی سازی سرم (SN) ToBi test, Toxoid tetanus, Antibody titration, ELISA test 93 99 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3275-1&slc_lang=fa&sid=1 Esmaeil Asli اسماعیل اصلی e.asli@rvsri.ac.ir 3900319475328460036430 3900319475328460036430 Yes Agricultural, Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran بخش تحقیق و توسعه، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقِقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، اِیران Roya Sadri رویا صدری royasadri@rvsri.ac.ir 3900319475328460036431 3900319475328460036431 No Agricultural, Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقِقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، اِیران