fa طراحی و ساخت کانسترکت نوترکیب واجد ژن اینترفرون بتای جهش یافته در ناحیه‌ کزاک (Kozak) به منظور تشدید ترجمه ژنتیک Genetic پژوهشي Research <p dir="RTL" style="line-height: 20.8px text-align: justify"><strong>زمینه و هدف:</strong>&nbsp;اینترفرون بتا یکی از مهمترین اعضای گروه<span dir="LTR">&nbsp;I&nbsp;</span>اینترفرون‌ها بوده و به عنوان داروی اصلی در بسیاری از بیماری‌ها از جمله بیماری مالتیپل اسکلروزیس استفاده می<span dir="LTR">‌</span>شود. پروتئین اینترفرون بتا واجد نیمه‌ی عمر کمی بوده و لذا بیماران به دریافت مکرر دارو نیازمند می‌باشند. با توجه به اهمیت دارویی پروتئین اینترفرون بتا، امروزه تلاش‌های گسترده‌ای در جهت بهبود سطح ترجمه و افزایش تولید آن صورت پذیرفته است. چندین عامل مهم می‌تواند بر روی میزان بیان پروتئین در سلول تأثیر گذار باشند که توالی مناسب احاطه کننده کدون آغاز (توالی کزاک) از جمله‌ی آن موارد می‌باشد.</p> <p dir="RTL" style="line-height: 20.8px text-align: justify"><strong>روش کار:</strong>&nbsp;پرایمرهای اختصاصی جهت ایجاد جهش هدفمند در توالی کزاک با استفاده از روش&nbsp;<span dir="LTR">SOEing PCR</span>&nbsp;(<span dir="LTR">Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR</span>) طراحی و&nbsp;<span dir="LTR">PCR&nbsp;</span>&nbsp;انجام شد. به منظور ایجاد جهش مورد نظر در ژن اینترفرون بتا سه واکنش&nbsp;<span dir="LTR">PCR</span>&nbsp;انجام پذیرفت. محصول نهایی جهش یافته و پلاسمید&nbsp;<span dir="LTR">pSVM</span>، برش داده شده و متعاقبا اتصال بین محصولات برش داده شده توسط لیگاز انجام گرفت. پس از ترانسفورماسیون با استفاده از مخلوط لایگیشن، استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از تولید کانسترکت و تأیید با استفاده از روش‌های هضم آنزیمی و<span dir="LTR">&nbsp;PCR&nbsp;</span>کانسترکت نوترکیب به رده‌ی سلولی<span dir="LTR">&nbsp;CHO&nbsp;</span>&nbsp;با استفاده از کیت لیپوفکتامین ترانسفکت گردید.</p> <p dir="RTL" style="line-height: 20.8px text-align: justify"><strong>یافته‌ها:</strong>&nbsp;در تحقیق حاضر با استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیک کانسترکت نوترکیب اینترفرون بتا تولید گردید. در این کانسترکت با استفاده از روش<span dir="LTR">&nbsp;SOEing PCR&nbsp;</span>و ایجاد جهش‌های هدفمند در ناحیه‌ی توالی کزاک، توالی مذکور به حالت ثابت نزدیک گردید. کلنی‌های سفید رنگ بر روی محیط کشت پس از ترانسفورماسیون مشاهده گردید. استخراج پلاسمید از کلنی‌ها انجام گرفته و صحت کانسترکت نوترکیب با استفاده از هضم آنزیم و همچنین&nbsp;<span dir="LTR">PCR</span>&nbsp;تأیید گردید. طول قطعه‌ی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی صحت کلون نمودن ژن نوترکیب اینترفرون بتا را تأیید نمود. پس از تأیید فرایند کلونینگ، سلول‌های&nbsp;<span dir="LTR">CHO</span>&nbsp;کشت داده شده و ترانسفکشن پلاسمید نوترکیب به رده‌ی سلولی&nbsp;<span dir="LTR">CHO</span>&nbsp;صورت گرفت.</p> <p dir="RTL" style="line-height: 20.8px text-align: justify"><strong>نتیجه‌گیری:</strong>&nbsp;جهش هدفمند در توالی کزاک ژن اینترفرون بتا صورت گرفت. جهش مورد نظر بر روی توالی کزاک می‌تواند سبب بهبود و افزایش میزان ترجمه پروتئین اینترفرون بتا گردد. در مراحل بعدی میزان تأثیر جهش در روند تولید پروتئین با استفاده از روش‌&nbsp;<span dir="LTR">&nbsp;ELISA</span>بررسی خواهد شد.&nbsp;</p> <p><strong>Background:</strong> Interferon beta is one of the most important members of group I interferons and is the main drug for multiple sclerosis treatment. Interferon beta has short half life and this compels patients to make frequent use of medicine. According to its clinical usage there is broad effort to improve translation level and protein production. There are several important factors which effect protein production that Kozak sequence is one of the most important one.</p> <p><strong>Method:</strong> Specific primers were designed due to induce site directed mutations by SOEing PCR (Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR) method. Three PCR reactions needed to amplify recombinant interferon beta gene. The final recombinant gene and pSVM plasmid were digested by <em>Eco</em>RI and then ligated by DNA ligase enzyme. After transformation plasmid extraction was done and the structure of the recombinant plasmid confirmed by digestion and PCR. Finally, approved recombinant plasmid was transfected to CHO cell line by using Lipofectamine kit.</p> <p><strong>Result:</strong> Genetic engineering methods were used to produce recombinant interferon beta gene. Production of recombinant construct including specific mutations in Kozak sequence was done by using SOEing PCR method. The white colonies were detected after transformation. Plasmid extraction was done and the structure of recombinant plasmid was confirmed by digestion and PCR. Expected length of fragment was observed after digestion. The CHO cells were cultured and recombinant plasmids were transfected to CHO cell line.</p> <p><strong>Conclusion:</strong> These mutations will enhance and improve interferon beta protein production. The influence of these mutations in protein production will survey by using ELISA method in next phase of research.&nbsp; &nbsp;</p> توالی کزاک, اینترفرون بتا, SOEing PCR, رده‌ی سلولی CHO Kozak sequence, Interferon beta, SOEing PCR, CHO cell line 68 77 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-1752&slc_lang=fa&sid=1 مریم کی Maryam_kay2001@yahoo.com 3900319475328460031045 3900319475328460031045 No دانشجوی دکتری ژنتیک مولکولی، گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران زهره حجتی z.hojati@sci.ui.ac.ir 3900319475328460031046 3900319475328460031046 Yes دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران مریم حیدری 3900319475328460031047 3900319475328460031047 No کارشناس ارشد ژنتیک، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران