Razi Journal of Medical Sciences

fa تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب توسط سلول تخمدان هامستر چینی و بررسی فعالیت زیستی آن به روش سنجش گزارشگر ژنی Production of recombinant human growth hormone by eukaryotic CHO cell and measurement of its biological activity by gene reporter assay میکروبیولوژی Microbiology پژوهشي Research زمینه و هدف: سلول‎های کشت شده پستانداران به خاطر تواناییشان در ایجاد ساختار صحیح پروتئین، تجمع و اصلاحات پس از ترجمه‎ای، سیستم مطلوبی برای تولید پروتئین‎های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی هستند، بنابراین زمانی که یک پروتئین در سلول‎های پستانداران بیان ‎شود در مقایسه با سایر میزبان‎ها از جمله باکتری‎ها،کیفیت واثر بهتری، دارد. سیستم‌های گزارشگر ژنتیکی ((Gene reporter systems به عنوان ابزاری برای مطالعه‌ تنظیم و بیان ژن‌ها در سلول‌های یوکاریوتی Eukaryotic) ( می‌باشند. ژن‌های گزارشگر دارای کاربردهای ویژه‌ای هستند و اغلب به عنوان شاخصی برای فعالیت رونویسی در سلول‌ها به کار می‌روند.<o:p /> روش کار: در این پژوهش تجربی ابتدا هورمون رشد انسانی نوترکیب (rhGH= recombinant human Growth Hormone) توسط یک کلون پایدار از سلول‌‌های CHO نوترکیب (recombinant Chinese Hamster Ovary) تولید و با روش‌هایی مانند الیزا<a href="mw:c11:enzyme-linked%20immunosorbent%20assay"><span style="color: windowtext font-family: "Times New Roman","serif" font-size: 9pt text-decoration: none mso-bidi-language: FA mso-bidi-font-size: 10.0pt mso-bidi-font-family: "B Mitra" text-underline: none" dir="ltr">(ELISA = Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)</a> و وسترن بلات(Western blotting)تولید آن اثبات گردید. سپس فعالیت زیستی هر دو نوع rhGH یوکاریوت و نوع تجاری به روش سیستم گزارشگر ژنی (سیستم گزارشگر LHRE-TK-Luc) بررسی و بایکدیگر مقایسه شدند. این سیستم شامل LHRE (Lactogenic Hormone Responsive Element)، پروموتور TK (Thymidine Kinase promoter) و ژن تحت کنترل آن، Luc کدکننده برای آنزیم فایرفلای لوسیفراز (Firefly luciferase) می‌باشد و امکان بررسی و اندازه‌گیری انتقال پیام ایجاد شده توسط GH در سلول‌های ترانسفورم شده با ژن GHR را فراهم می‌کند. برای این منظور از سلول‌های HEK293 Human Embryonic Kidney 293 cells ترانسفکت شده با گیرنده هورمون رشد استفاده شد و فرایند انتقال پیام درون سلولی القا شده توسط rhGH و در نتیجه بیان آنزیم لوسیفراز و به دنبال آن تولید نور توسط دستگاه لومینومتر اندازه‎گیری شد.<o:p /> یافتهها: نتایج اولیه نشان دادند که میزبان نوترکیب (rCHO) به خوبی تولید کننده rhGH می باشد. از طرفی نتایج حاصل از سیستم بررسی فعالیت زیستی نشان دادند که rhGH یوکاریوت به خوبی فرایند سیگنالینگ درون سلولی را القا می‌کند و حتی در مقایسه با نوع تجاری موجود، نوع یوکاریوت دارای فعالیت زیستی بهتری می‌باشد.<o:p /> نتیجهگیری: سلول های کشت شده پستانداران میزبان های بسیار مناسب و ایمنی برای تولید پروتئین های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی می باشند. روش سیستم گزارشگر ژنی (Gene reporter assay) یک روش بسیار حساس، کارا، دقیق و ایمن برای بررسی فعالیت زیستی پروتئین های نوترکیب می باشد.<o:p /> Background: Cultivated mammalian cells, because of their capacity for proper protein folding, assembly and post–translational modification, have become the dominant system for production of recombinant proteins in clinical application. Therefore, the quality and efficacy of protein can be superior when expressed in mammalian cells compared to other hosts such as bacteria. Gene reporter systems have contributed greatly to the study of eukaryotic gene expression and regulation. Although reporter genes have played a significant role in numerous applications, both in vitro and in vivo, they are most frequently used as indicators of transcriptional activity in cells. Luciferase-reporter assays are widely used to monitor the cellular events related to transduction and gene expression regulated by specific cascades, such as PRL/Jak2/Stat5 pathway.<o:p /> Methods: In this study, recombinant human growth hormone (rhGH) was produced in eukaryotic Chinese hamster ovary (CHO) cell and production and concentration of rhGH verified by ELISA and western blotting. Then, the biological activity of rhGH was assessed by a gene reporter assay system (containing LHRE, TK promoter and Luc gene), using HEK 293 cells transfected with GH receptor and response element for STAT-5 measuring luciferase activity on a Berthold luminometer.<o:p /> Results: The date showed that rhGH could be produced by eukaryotic host in good quantities as assessed by ELISA and western blotting. The results of gene reporter assay showed that rhGH produced by CHO cells is able to induce GH intracellular cell signaling. The rhGH produced by CHO cells showed higher bioactivity when compared to commercial GH.<o:p /> Conclusion: rhGH could be produced in mammalian cell lines at high levels with higher bioactivity. Gene reporter assay is a sensitive, quantitative, rapid, easy, reproducible and safe system for assessment of bioactivity of recombinant proteins such as rhGH.<o:p /> سلول تخمدان هامستر چینی، هورمون رشد انسانی نوترکیب، سنجش زیستی، سیستم گزارشگر ژن، الیزا. Chinese hamster ovary (CHO), Human growth hormone (hGH), Bioassay, Gene reporter assay, ELISA. 1 9 http://rjms.iums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-1372&slc_lang=fa&sid=1 Marzeieh Rezaei مرضیه رضائی 3900319475328460022500 3900319475328460022500 Yes University of Isfahan دانشگاه اصفهان Seyyed Hamid Zarkesh-Esfahani سید حمید زرکش اصفهانی 3900319475328460022501 3900319475328460022501 No University of Isfahan دانشگاه اصفهان